科研 | Ecotoxicol Environ Saf：丙烯酰胺可抑制自噬，诱导细胞凋亡并改变细胞代谢谱（国人佳作）

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

丙烯酰胺（ACR）是富含碳水化合物的食物在高温热加工过程中产生的，可通过摄食、吸入和皮肤接触直接进入人体。ACR的毒性已被广泛研究。这些研究的主要结果表明，暴露于ACR可引起动物和人类的神经毒性，并在啮齿类动物模型中显示出生殖毒性和致癌性。然而，ACR的毒性机制尚未被代谢组学方法所研究，ACR对自噬的影响尚不清楚。在这里，我们用ACR处理U₂OS细胞6 h和24 h并收集供进一步研究。我们已经证明ACR抑制自噬通量，增加ROS含量。ROS的积累导致细胞凋亡率和炎症因子分泌增加。此外，根据多种分析模型，ACR处理的细胞和对照细胞的代谢谱存在显著差异。我们共鉴定出73种关键的差异代谢物，它们参与多种代谢途径。其中，暴露于ACR通过降低糖酵解中间产物的水平引起糖酵解/糖异生减弱，降低TCA循环的速率，同时升高几种氨基酸代谢物和脂质代谢物的水平。总之，我们的研究通过代谢组学和多种生物分析方法提供了ACR引起细胞毒性的有用证据。

论文ID

原名：Acrylamide inhibits autophagy, induces apoptosis and alters cellular metabolic profiles译名：丙烯酰胺可抑制自噬，诱导细胞凋亡并改变细胞代谢谱
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872发表时间：2021.01通讯作者：刘蓉
通讯作者单位：南京农业大学

实验设计

实验结果

1. ACR诱导自噬空泡的积累
为了确定ACR对自噬的影响，我们用不同浓度的ACR处理U₂OS细胞6小时。Torin2（50 nM）和CQ（2 μM）分别作为促进和抑制自噬的对照（下同）。LC3是参与自噬体形成的重要自噬蛋白。Western blotting法检测LC3-II的表达水平。这一结果表明，10 nM-10μM的ACR处理显著增加了LC3-II水平（图1A，B）。然后，我们用1 μM剂量的ACR处理U₂OS细胞不同时间。信号与β-微管蛋白的信号进行归一化。从1小时到6小时，LC3-II水平以时间依赖性方式显著增加（图1C，D）。综上所述，这些结果表明ACR诱导自噬空泡积聚。 图1 ACR处理诱导U₂OS细胞中LC3-II的积累
(A)不同浓度ACR处理U₂OS细胞6 h, western blotting检测LC3-II水平。(B) A中U₂OS细胞三次实验LC3-II的统计分析。(C)用1 μM ACR处理不同时间的U₂OS细胞，western blotting检测LC3-II水平。(D) C中三次重复实验LC3-II的统计分析。 2. ACR阻断自噬降解
据报道，自噬空泡的积累可能是由于自噬体形成加速或自噬降解受阻所致。p62是一种重要的自噬蛋白，在自噬体与溶酶体融合过程中被降解。用10 nM-10 μM的ACR处理细胞，p62水平显著升高。这一结果与LC3-II水平升高一致（图2A，B），从3小时到6小时ACR显著升高p62水平，（图2C，D）。很明显，ACR治疗以剂量和时间依赖的方式显著增加p62水平。这些结果表明ACR抑制自噬降解。 图2 ACR处理可抑制U₂OS细胞的自噬降解
(A)不同浓度的ACR处理U₂OS细胞6 h，western blotting检测p62水平。(B) A中U₂OS细胞三次实验p62的统计分析。(C)用1 μM ACR处理不同时间，western blotting检测p62水平。(D) C中三次实验p62的统计分析。 3. ACR阻断自噬通量
以上结果表明，ACR暴露可引起LC3-II和p62水平的积累，其作用与CQ类似。因此我们推测ACR可能阻断自噬通量。随后，我们进行了自噬通量测定以进一步验证这一假设。我们用不同的处理方法处理U₂OS细胞，如图3所示。我们发现ACR治疗提高了p62水平。与ACR单独治疗相比，Torin2加ACR治疗后LC3-II水平进一步积累。综上所述，这些结果表明ACR阻断了自噬通量，这种作用与CQ相当。 图3 ACR阻断自噬体的成熟
(A) U₂OS细胞与自噬激活剂Torin2、溶酶体抑制剂氯喹(CQ)、Torin2 + CQ或1 μM ACR与/不Torin2 Torin2孵育6小时。通过western blotting分析LC3-II和p62水平。(B, C) A中三个独立实验的LC3-II和p62水平的相对定量。 4. ACR可诱导ROS积累、细胞凋亡和炎症反应
我们先前的研究表明，阻断的自噬通量可能导致活性氧积累。因此，我们通过将DCFH-DA转化为荧光染料2，7-二氯荧光素来检测ROS水平（图4A，B）。这一结果表明ACR显著增加了ROS的产生。此外，ROS的产生可诱导细胞凋亡甚至坏死。流式细胞术结果表明，在ACR处理下，细胞凋亡率（Q2+Q3）增加（图4C）。同样，我们的定量实时PCR结果显示ACR显著增加促凋亡基因Bax（Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员）的mRNA水平，Caspase3和Caspase8（Caspases是参与细胞凋亡激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）和Bcl-2（抗凋亡基因）mRNA表达水平降低（图4D）。此外，我们观察到炎症相关基因白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子α的转录水平在ACR治疗后显著上调（图4E）。这些结果暗示ACR可增加ROS含量，诱导细胞凋亡和炎症的产生。 图4 ACR增加ROS含量，诱导细胞凋亡和炎症的产生
（A）将DCFH-DA转化为荧光染料2，7-二氯荧光素，免疫荧光法检测ROS。（B）ROS荧光强度的定量，通过t检验进行分析。（C）ACR治疗后细胞凋亡的流式细胞术分析。（D）U₂OS细胞凋亡相关基因mRNA水平的研究。Bax：Bcl-2（β细胞淋巴瘤-2）蛋白家族的促凋亡成员，Caspase3和Caspase8：参与细胞凋亡激活的蛋白酶，Bcl-2，促凋亡蛋白作用的抑制剂。（E）U₂OS细胞炎症相关基因IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平的研究。 5. 代谢组学分析
多变量统计分析比较ACR治疗组和对照组间代谢组的差异。我们首先对质控样品的PCA评分图进行分析，评价高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）系统的稳定性和重复性。我们注意到，QC样品的PCA分析显示出紧密的聚类，其他组之间有明显的分离，没有重叠，表明HPLC-MS/MS系统具有很高的稳定性（图S1A）。随后，我们进行PCA模型分析，比较ACR治疗组和对照组之间的离散差异。如图S1B所示，PCA评分曲线在不同组之间表现出明显的分离（PC1和PC2的总和解释了总变异的61.9%）。此后，我们进行PLS-DA进一步验证差异，如图S1C所示，我们可以在ACR组和对照组之间的PLS-DA评分图上观察到明显的分离（R2=0.995，Q2=0.829）。此外，我们对模型参数进行了200次置换试验，以验证PLS-DA模型的可靠性（图S1D）。R2截距和Q2截距分别为0.919和0.00157，Q2均低于R2，说明PLS-DA模型没有过度拟合和有效性。总的来说，这些结果表明ACR治疗组和对照组的代谢谱存在显著差异。在PLS-DA分析的基础上，我们采用变量重要性投影法（VIP>1，P<0.05）筛选两组主要代谢指标。在此，我们确定了73种关键代谢物，其水平受ACR治疗的影响（表S2）。具体而言，我们共鉴定出29种和24种正离子和负离子模式的差异代谢物，20种差异代谢物通过TSQ Quantiva鉴定。这些代谢物包括碳水化合物、脂类、氨基酸、有机酸和其他类型的化合物。在73种不同的关键代谢产物中，16种在ACR处理下显著降低，57种在ACR处理下显著升高。为了使两组之间的差异更加明显，Metaboanalyst3.0生成了热图（图5）。横坐标代表不同的治疗组，纵坐标代表各组的不同代谢物，红色代表ACR治疗组的代谢物增加，与对照组相比，绿色代表减少。很明显，ACR处理后大部分差异代谢产物上调。 图5 U₂OS细胞中ACR处理组和对照组代谢产物差异的层次聚类分析
行和列分别代表差异代谢物和实验样品。红框表示ACR处理下的代谢产物上调，绿框表示代谢产物下调。刻度表示折数的变化。 6. 代谢途径分析
代谢途径富集基于MetaboAnalyst 3.0的KEGG途径数据库生成。如图6A所示，我们根据丰富的途径分析，确定了许多代谢途径，前十位的主要改变途径包括心磷脂生物合成、Warburg效应、酮体代谢、糖异生、甘油脂质代谢、甘油三酯生物合成、丁酸代谢、，苏氨酸和2-氧代丁酸降解、柠檬酸循环、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解。表S3详细描述了主要的改变途径。代谢网络图如图6B所示。红色箭头表示ACR治疗组的较高水平，而绿色箭头表示ACR治疗组的较低水平。ACR组糖酵解和TCA循环中间产物的相对含量显著低于对照组，而部分氨基酸的相对含量显著高于对照组。总的来说，这一代谢网络显示了已鉴定的差异代谢物之间更直观的相关性。 图6 ACR改变多种代谢途径
(A) U₂OS细胞经ACR处理后富集代谢通路分析。(B) U₂OS细胞经ACR处理后主要差异代谢通路示意图。红色箭头代表上调的代谢产物，绿色箭头代表下调的代谢产物。

讨论

在本研究中，我们使用基于HPLC-MS的代谢组学结合多变量数据分析来研究ACR治疗的代谢谱。我们观察到，与对照组相比，从PCA、PLS-DA和层次聚类分析来看，ACR处理后在代谢谱上表现出明显的差异。我们共鉴定出73种差异代谢产物，它们在糖酵解、三羧酸循环、氨基酸代谢、脂类代谢等多个途径中表现出紧密的相关性。这一结果与先前的蛋白质组学结果相似，后者揭示了ACR诱导TCA循环和糖酵解途径中的蛋白质变化。在目前的研究中我们发现糖酵解/糖异生的变化。ACR处理后，一些糖酵解中间产物减少，如1,6-二磷酸果糖、磷酸二氢丙酮、3-磷酸甘油酯、6-磷酸葡萄糖酯、2-磷酸甘油酯和乳酸。糖酵解为大多数生物体的TCA循环提供底物。糖酵解中间产物的减少表明糖酵解代谢速率显著减慢，这也可能是TCA循环碳流量衰减的原因之一。TCA循环是细胞代谢途径的中心，参与合成代谢和分解代谢。它是氨基酸、脂肪酸和碳水化合物代谢的最终共同途径，也是人体能量供应最重要的代谢途径。在这项研究中，ACR治疗组的几种TCA中间体（异柠檬酸、苹果酸以及甲基丙二酸）水平显著降低。TCA中间产物水平的降低意味着TCA循环受限、线粒体呼吸缺陷和能量缺乏。一些研究表明，暴露于ACR会减弱线粒体电子转移链复合体的活性，表明氧化应激增加。Zhao等人已经证实，ACR诱导的神经毒性和遗传毒性与氧化状态和线粒体功能的变化有关。他们证明，暴露于ACR会导致ROS水平的过量产生，增加线粒体膜的通透性，降低ATPase和超氧化物歧化酶的活性。这与我们的结果一致，我们观察到ACR治疗显著增加ROS水平。虽然我们检测到富马酸水平较高，但这可能是由于L-苯丙氨酸水平升高，因为它可以转化为酪氨酸，然后进一步代谢为富马酸，然后进入TCA循环。Tang等人证实，累积的富马酸有助于增加活性氧的产生，这与TCA循环减弱有关。总之，我们的数据表明暴露于ACR会增加富马酸水平并诱导ROS积累，从而降低TCA循环速率。脂质及其衍生物是重要的细胞膜结构，在调节多种信号转导途径（如细胞增殖、凋亡和膜运输）中起着关键作用。在检测到的脂质中，溶血磷脂酸（LPA）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）和溶血磷脂酰甘油（LPG）的含量在ACR处理下显著增加。在大鼠模型中，高水平的LPA可诱导神经细胞凋亡和坏死。LPC作为一种重要的炎症介质，可诱导炎症蛋白的表达和线粒体ROS的产生，从而损害线粒体功能。因此，增加的脂质代谢物暗示暴露于ACR可促进ROS累积和细胞凋亡，我们的结果完全符合这一观点。此外，自身溶酶体成熟受损与脂质含量升高有关。在本研究中，我们的结果表明，暴露于ACR可显著上调自噬蛋白（LC3-II和p62）水平，阻断降解过程，从而抑制自噬，最终阻止脂质的降解和更新。这是首次阐明ACR在自噬中潜在作用的研究。此外，研究表明，活性氧作为细胞信号分子启动自噬体的形成和降解。相反，通过自噬去除受损的细胞器，如蛋白质聚集体和线粒体，氧化损伤和活性氧水平可以降低。因此，我们推测自噬通量的阻断可能也是ROS水平累积的原因之一。氨基酸是调节细胞生长发育和代谢途径的信号。我们注意到，在ACR处理下，一些已鉴定的氨基酸显著积累。其中，3-甲基组氨酸被确定为骨骼肌毒性的生物标志物。不对称二甲基精氨酸累积增加慢性肾病风险。据报道，补充L-苏氨酸可以缓解脂多糖诱导的肉鸡肠道炎症反应。因此，在我们的结果中，增加的L-苏氨酸可能对ACR诱导的炎症反应起到代偿作用。此外，有证据表明，在某些情况下，氨基酸是由自噬降解蛋白产生的，过量的氨基酸也可能降低自噬水平，因此，有人可能推测自噬通量的阻断与氨基酸水平的增加有关，而这些增加的氨基酸水平也可能是某些疾病的危险因素。在这项研究中，我们确定了ACR对自噬的潜在影响。LC3-II和p62水平的显著累积表明ACR通过阻断自噬通量抑制自噬。代谢组学结果表明，暴露于ACR可限制糖酵解和TCA循环代谢的速率，反之，可加速氨基酸和脂肪酸的代谢。此外，ACR可引起ROS积聚，诱导细胞凋亡和炎症。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33396091/

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